撰文 | 杨辉团队

责编 | 王承志

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在贺建奎公布的数据中（PPT第38页），19个经过编辑的人类胚胎，只有7个胚胎中的CCR5基因完全被编辑，其中4个为纯合基因突变。然而剩余的12个胚胎中仍含有一定比例未被编辑的CCR5基因。

由此可见，早期胚胎数据表明有超过60%的胚胎并未达到实验预期的效果，即获得免疫CCR5型的HIV病毒的婴儿。新出生的Nana也进一步证实了我们的担忧，她约一半的CCR5基因未被编辑，即没有获得免疫HIV的能力，又经受了基因操作所带来的风险。

受精卵时期注射CRISPR的方式往往无法避免嵌合体现象，因为一细胞阶段注射CRISPR体系之后编辑的双倍体基因组DNA往往已经进行了复制，无法保证所有拷贝都被进行了同样的敲除。也就是说，并不能保证婴儿的全身所有细胞都被编辑，这就是发生所谓的嵌合体现象。嵌合体现象也是近年来科研工作者极力攻克的目标。2017年我们团队在《细胞研究》（Cell Research）报道通过Cocktail的方法同时在一个基因上设计多个sgRNA（引导Cas9到基因组上的RNA链）的方法来减少F0代小鼠及猴中的嵌合现象，实现全身细胞的功能性敲除(1)。出生的一对基因编辑婴儿如果CCR5基因未做到全身性的纯合敲除，就无法达到贺建奎团队想实现的目标。

图1：Cocktail方法编辑小鼠胚胎。

然而考虑到Cocktail方法需要用到多个sgRNA，这可能会增加CRISPR/Cas9脱靶的风险。而近期许多研究报道，CRISPR/Cas9通过诱导DNA的双链断裂(DSB) 来提高基因敲除和修复的效率的方式，有可能造成DNA大片段缺失或者插入，以及染色体异常(2,3)。更何况这种技术只能适用于比较纯粹的基因敲除，对于更加精确的基因编辑，比如贺建奎这次原本计划的删除CCR5的32个碱基的方案，这种方法就不太适合。

为了尽最大可能消弭基因编辑带来的潜在风险，我们团队长年来一直致力于开发更加安全的基因编辑工具。2016年David Liu团队在《自然》（Nature）期刊上发表了单碱基编辑工具（BE3）首次实现可以在不引入DNA双链断裂的情况下对单碱基进行替换(4)，我们设想这种不涉DNA双链断裂的点突变手段或许能够比传统方法更加高效而安全，能为单基因遗传病的治疗带来了新的希望。我们团队因此想利用单碱基编辑系统在人胚胎中进行高效的单碱基替换，研究人类早期胚胎发育过程以及用于修复单基因点突变的可能性。

在我们一项尚未发表的研究中发现，单碱基编辑系统在人的受精卵阶段部分位点的编辑效率依旧很低（<20%）。我们认为这和人类胚胎 (4-8 细胞阶段) 的合子基因激活 (ZGA) 的发生通常比小鼠胚胎 (2 细胞阶段) 晚有关。为了解决这个问题，我们研究了在受精后不同时间点人类胚胎中单碱基编辑系统的效率。我们发现在胚胎发育的2细胞和4细胞时期注射，单碱基编辑系统BE3的编辑效率得到了显著的提高。不仅如此，在2细胞时期纯合编辑的卵裂球可以达到从受精卵注射的20%提高到80%。

然而，即便如此高的编辑效率，我们仍发现有一定比例胚胎仍含有未经基因编辑修复的卵裂球。如果贸然将类似的技术用于临床，诸如这样的胚胎发育成个体后仍有患病的可能。因此在将其应用到病人身上还需要进行更慎重的安全性评价和伦理学的讨论。

从以往的经验来看，基因编辑的高效率往往会伴随高脱靶率的问题。我们在大幅提升BE3系统的编辑效率后便对其脱靶问题做了大量分析。我们首先借助于传统方法，也就是先用软件对sgRNA的潜在脱靶位点做出预测，然后对这些潜在脱靶位点进行测序分析。为了更进一步将基因编辑带来的突变与小鼠自身的基因突变区分开来，我们在两细胞时期对其中一个卵裂球注射BE3系统和指示的GFPmRNA（绿色荧光蛋白mRNA），待卵裂球发育至8细胞时期研究人员通过荧光标签分离出编辑组和非编辑组的卵裂球通过全基因组扩增后进行全基因组测序。分析在CRISPR/Cas9所能够预测到的数万个off-target位均未检测到脱靶现象。

然而，尽管我们已经用了当时最高精度的脱靶分析检测，但这作为一项可能会用于临床的技术，我们依旧要问，这种程度的脱靶分析真的足够评估其风险吗？

无独有偶，在贺建奎公布的数据中（PPT第39页），针对19个经过编辑的人类胚胎，他们做了全基因组高通量测序（WGS）后也得出了没有脱靶的结论。

但如果仔细考虑这个问题的话，我们发现，由于胚胎细胞数比较少，做WGS之前，他们需要对每个胚胎的DNA进行全基因组体外预扩增。这一体外扩增处理，会额外引入许多突变，使得我们检测真实突变的难度增大。从WGS可以看出，数据未过滤前，每个胚胎含有几百万个indels（插入或缺失突变）。即便把遗传来源的indels过滤掉，也有几十万个。至于之后的一系列过滤方法，都存在一定的局限性和偏向性，无法排除这些脱靶是由于CRISPR/Cas9基因编辑导致的可能。所以，根据他目前公布的数据，完全不能说明CCR5的基因编辑是安全的，无脱靶的。而这也是现阶段绝大多数脱靶分析存在的问题。

我们团队虽然做了很多胚胎基因编辑的基础研究，并将其应用于早期胚胎发育及基因治疗。然而随着测序技术的发展及产前诊断（PGD）技术的成熟，切实需要胚胎基因治疗的案例少之又少——比如夫妻双方因为同一个基因纯合突变导致疾病，生出的小孩必定患病。遇到这种情况，我们一般会建议夫妻一方接受供精或供卵，即便现在提出基因治疗申请，目前的技术还远未成熟，何况还涉及到一系列伦理问题，需要整个领域的科学家以及全社会参与进来进行讨论。

同时需要指出的是，贺建奎团队利用基因编辑敲除正常基因来达到疾病预防的目的并不是基因编辑的主流方向。大部分科学家更倾向于利用基因编辑技术精确修复致病基因突变，从而治疗一些传统手段无法治疗的疾病。虽然借助外源DNA模板CRISPR/Cas9能够引入精确的修复，但是在人类胚胎中精确编辑的效率非常低(<10%)，而且编辑后的嵌合体合现象非常严重(5)，因此极大的限制了CRISPR/Cas9在人类遗传病的基因治疗中应用。

我们团队一系列工作表明，通过改进外源DNA模板的方式，可以极大的提高CRISPR/Cas9在小鼠、猴及人胚胎中的精确编辑的效率（>50%）(6-10)，然而目前效率仍远未达到临床应用的标准（>95%,无嵌合，零脱靶）。所以胚胎治疗的路，任重道远。

而相比于胚胎治疗，成体治疗的适用性就大了很多。成体治疗一般不涉及对生殖细胞的修改，而且患者对此有充分知情权，可以“风险自担”，而且一般都只针对有死亡或严重生活障碍且没有其它疗法的疾病，相对而言伦理问题比较容易解决。目前我们已知的遗传性疾病有七千余种，其中绝大部分缺乏有效的治疗药物和方法，而基因治疗的提出为患者带来了曙光。欧美多个国家已经或即将利用基因编辑开展成人体细胞基因治疗临床研究，治疗严重感染或遗传疾病。基因替代疗法（使用病毒等载体将正确的基因放进细胞，而非基因编辑）无疑是精准治疗中除肿瘤靶向治疗之外最具有代表性的精准治疗成功案例，其标志性成果就是对RPE65基因突变所致的Leber先天性黑矇的临床试验。结果显示，治疗后患者的视敏度及瞳孔反射有一定的改善。我第一次接触到罕见病家属，还是因为我们实验室的一个发现：CRISPR/Cas9技术可以介导整条染色体的敲除，有望用于治疗唐氏疾病（三条21号染色体）(11)。之后通过不断与病人家属的互动，我们实验室的方向逐渐转向成体治疗，基于人类遗传性疾病的相关基因突变，包括遗传性致盲眼病、先天性耳聋、脊髓性肌萎缩症，用基因编辑技术建立相应的人源化小鼠模型，以模拟人体内疾病的发生和发展，并且在此基础上探索和研发有效的基因疗法手段，从而为相关的人类遗传性疾病的后续药物开发和治疗提供重要的治疗方案和思路。

最后，我们想说，在目前安全性无保证，伦理问题没有解决的情况下，我们坚决抵制基因编辑技术用于修饰人类胚胎和生殖细胞的临床应用，强烈谴责贺建奎课题组利用CRISPR技术获得基因编辑婴儿的行为。

我们认为，像贺建奎这样的行为绝不能代表中国科学家的工作态度，相信中国绝大多数科学家都会秉持严谨的态度，认真对待研究的伦理和规范，尽力将优质、安全且符合社会与学术界一切规范的成果呈现给世人。

 参考文献：

1.  E. Zuo et al., One-step generation of complete gene knockout mice andmonkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res 27, 933-945 (2017).

2.  M. Kosicki, K. Tomberg, A. Bradley, Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. NatBiotechnol 36, 765-771 (2018).

3.  H. Y. Shin et al., CRISPR/Cas9 targeting events cause complex deletions andinsertions at 17 sites in the mouse genome. NatCommun 8, 15464 (2017).

4.  A. C. Komor, Y. B. Kim, M. S. Packer,J. A. Zuris, D. R. Liu, Programmable editing of a target base in genomic DNAwithout double-stranded DNA cleavage. Nature533, 420-424 (2016).

5.  P. Liang et al., CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclearzygotes. Protein & cell 6, 363-372 (2015).

6.  H. Yang et al., One-Step Generation of Mice Carrying Reporter andConditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 154, 1370-1379 (2013).

7.  X. Yao et al., CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using aHomology-mediated End Joining-based Strategy. Journal of visualized experiments: JoVE,  (2018).

8.  X. Yao et al., CRISPR/Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration InVivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine,  (2017).

9.  X. Yao et al., Generation of knock-in cynomolgus monkey via CRISPR/Cas9editing. Cell Res,  (2018).

10.  X. Yaoet al., Tild-CRISPR Allows for Efficient and Precise Gene Knockin in Mouseand Human Cells. Dev Cell 45, 526-536 e525 (2018).

11.  E. Zuoet al., CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination. Genome Biol 18, 224(2017).

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