中国学者在Science发表两篇论文,同时揭示碱基编辑器脱靶奥秘-深度-知识分子

中国学者在Science发表两篇论文,同时揭示碱基编辑器脱靶奥秘

2019/03/01
导读
3月1日, Science背靠背报道了中国学者杨辉团队、高彩霞团队及其与合作者分别在动物,植物进行的碱基编辑器研究成果,一致揭示了脱靶原因是胞嘧啶编辑器所导致的大量单核苷酸突变。

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撰文 | 何东明

责编 | 叶水送


  


碱基编辑器是一种CRISPR-Cas9的重要衍生技术,包括胞嘧啶编辑器与腺嘌呤编辑器cytosine/adeninebase editors,CBE,ABE),它能实现单碱基定点突变,在精准疾病治疗与作物改良等方面常被寄予厚望。但其脱靶问题长期未能解决,脱靶会存在致癌等风险,很大程度上限制了其进一步的实际应用。


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Science背靠背发表论文


3月1日, Science背靠背报道了中科院上海神经科学研究所杨辉团队、中科院遗传发育所高彩霞团队及其与合作者的最新成果[1][2],他们分别在小鼠与水稻上开展碱基编辑器研究,通过全基因组深度测序,同时揭示了脱靶原因是胞嘧啶编辑器(CBE系统,包括BE3)所导致的大量单核苷酸突变。同时,他们发现先前认为的高精准度BE3也有非常严重脱靶问题,且脱靶位点不能由经典方法来预测。

 

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研究试验方案设计

 

杨辉是基因编辑动物胚胎构建的专家,曾取得通过CRISPR-Cas技术来实现一步法构建携带多突变小鼠的重要成果[3]。此次他的课题组与合作者巧妙的成功构建了一种名叫GOTI(Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection)的脱靶检测技术。这样就很好地避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题,且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵,理论上基因背景完全一致。因此直接比较两组细胞的基因组,其中的差异就可认为是基因编辑所造成的。


高彩霞团队采用的是其研发的高效植物碱基编辑器系统[4],通过设计严谨的对照组来有效消除了背景噪音,结合全基因组深度测序进行比较分析,同样实现了精密的脱靶检测,发现之前无法发现的大量突变。

 


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水稻试验发现脱靶产生的SNV突变在胞嘧啶编辑系统(BE3,高保真HF1-BE3)显著增多


脱靶原因的矛头指向胞嘧啶编辑器


在确保靶位点编辑效率的情况下,通过全基因组深度测序分析,两个研究团队同时发现,插入/缺失突变率很低且各组之间差异不大,但CBE系统,包括早前认为高精确性的BE3系统都产生全基因组大范围的点突变。小鼠的研究发现,ABE组每个胚胎平均出现10个点突变,这在发育所产生的随机突变范围内[5],而BE3组出现的点突变数量则是ABE组的20倍以上。


杨辉团队还比较了经典 CRISPR/Cas9与碱基编辑器的差异,发现CRISPR/Cas9组每个胚胎平均只出现12个点突变,说明设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应,由此可结束早前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。


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小鼠试验结果分析,脱靶主要是CBE系统导致,设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应



经典方法无法检测出脱靶造成的大量随机突变


水稻与小鼠的实验结果分析都发现,脱靶位点都不能通过现有软件来进行预测。他们发现,脱靶出现的突变位点的连接序列与靶序列并无相似性,脱靶序列与靶序列之间也没有相似性,这些都与经典预测方法的结果相反。小鼠研究表明,即使是BE3组内的不同个体,脱靶位点也没有序列相似性。同时,传统脱靶检测方法不能发现BE3的脱靶效应。这些都强烈提示出,现有软件预测,高通量测序检测DNA双链断裂(Double-Strand Break,DSB)等脱靶位点检测方法,都存在很大的局限性。

 

碱基编辑器技术方兴未艾,杨辉与高彩霞作为领域里的著名学者,已取得许多重要的研究突破。此次,他们的研究成果将为研发高精度的基因编辑技术指明方向,有力促进其应用和发展。


参考文献

1. E. Zuo et al., Science 10.1126/science.aav9973 (2019).Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos.

2. S. Jin et al., Science 10.1126/science.aaw7166 (2019).Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice

3. Wang, H., Yang, H., Shivalila, C.S., Dawlaty, M.M., Cheng, A.W., Zhang, F., and Jaenisch, R. (2013). One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153, 910-918

4. Y. Zong, Y. Wang, C. Li, R. Zhang, K. Chen, Y. Ran, J.-L. Qiu, D. Wang, C. Gao, Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat. Biotechnol. 35, 438–440 (2017).

5. J. W. Drake, B. Charlesworth, D. Charlesworth, J. F. Crow, Rtes of spontaneous mutation. Genetics 148,1667-1686(1998).


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