最近，关于新冠肺炎核酸检测假阴性的问题得到多家媒体报道。《南方周末》的报道显示，在浙江一所医院，有的病人测了6次核酸试剂都为阴性，直到第7次才测出阳性。而刚刚去世的李文亮医生，在1月11、12号就有发热症状住院，之后住进重症监护室，但两次核酸检测结果均为阴性，直到2月1日核酸检测结果才显示阳性。
2月5日，危重症医学专家、中国医学科学院院长王辰院士接受央视采访时表示，“对于真是这个病的病人，也不过只有30%-50%的阳性率。通过（采集疑似病患）咽拭子的办法，还是有很多假阴性的。核酸没有发现，但是实际上是的。”
从理论上来说，符合质量标准且经过临床验证的核酸试剂盒检测是确诊新冠肺炎的金标准，为何现在核酸检测的假阴性如此之高？
《知识分子》邀请南京医科大学公共卫生学院流行病学系教授杨蓉西，来解读有关诊断试剂盒的问题。
（图源：cdc.gov）
撰文 | 杨蓉西
编辑 | 陈晓雪
据财新等媒体2月7日的报道，北京中日友好医院收治了一名武汉来京发热肺炎患者，该患者入院前，三次咽拭子新冠病毒核酸检测均为阴性，甲流核酸检测阳性，但入院后插管上呼吸机，通过肺泡灌洗检测发现新冠病毒核酸阳性。通过报道也看到，武汉的很多医生反馈，核酸检测试剂盒核酸检出率低，许多病例要重复多次检测，有的病人咽拭子阴性但肺细胞灌洗液里有病毒。为何会出现这样的情况？这需要从体外诊断试剂盒的研发及临床试验流程说起。为何确诊以核酸检测为主？
首先，诊断新冠肺炎，在分子生物学的手段上，目前常用的办法有两种：一种是病毒的基因测序，一种是核酸检测。二代测序因为可以检测微量物质，所以可以适用的体液类型更多。但是大多数医院没有测序的设备。尤其是二代测序，不仅仅需要设备，还需要生物信息团队来协助测序结果的解读。但是就算如此，研发阶段的流程和试剂配比的优化，阳参阴参的设立，以及预临床试验也是需要的。而且，因为二代测序的成本高检测周期也比较长，不一定适合做这个检测。所以，现在的诊断方法以核酸检测（PCR或者real-time PCR）为主，这主要受制于：试剂盒质量（而非产能），能够承担临床检测的P3实验室（生物安全3级实验室）数量，P3实验室设备的准确性和稳定性，能进行熟练稳定操作的工作人员人数。在实际临床应用的时候，除了高质量的试剂盒以外，样本的类型，样品的收集运输和储存方法，核酸（RNA）提取方法，检测设备（PCR仪器或real-time PCR仪）的准确性和稳定性，操作人员的技术，都会影响到实际的检测效果。除此以外，因为考虑到检测的样品具有高度的传染性，用于做此检测的实验室理论上应是P3实验室。检测实验室内部需要做严格的防护，净化负压等等都是最基本的，对于操作流程也有严格的规范。如果实验室级别达不到，可能实验室感染的隐患。正常开发检测试剂盒，需要3-5年的时间
PCR或者real-tine PCR的试剂盒，正常情况下IVD三类试剂盒（核酸类是三类证）从研发到临床再到拿证要3-5年，甚至更长。
1）研发：研发一开始可以用合成的核酸序列来进行。优化试剂盒的各种组分：比如Mg2+的浓度，哪一种聚合酶扩增效率更高更稳定，引物浓度，PCR的退火延申时间循环数等等。同时要确定检测的质控盘，什么是阳性样品什么是阴性样品，要了解检测的最低拷贝数是多少。同时还得确定到底检测什么了类型的标本，以及标本收集的流程。
2）预临床试验：用符合收集流程获得的临床阳性样品（在这里指的是阳性患者的样品）和临床阴性样品（临床上确认未感染的人）来验证试剂盒是否真的有效。而且不能用一两个临床，正常情况需要在数百个甚至上千个临床样品中进行测试，因为每个人的病毒拷贝数是不一样的，由此来得到试剂盒大致的灵敏度和特异性。3）试生产：这个需要建设符合标准的GMP车间，然后按照标准流程来进行多个批次的生产。4）报国家中检院进行质量检，由质检部门抽取不同的生产批次来检测其质量以及稳定性。5）正式的临床试验：用生产出来的试剂盒在注册的临床实验中进行双盲检测（至少两家有临床试验资质的三家医院，1000例以上的临床标本其中阳性样品300例以上），由此了解试剂盒在临床应用时的灵敏度和特异性是否符合预期。简化流程，这些步骤不能少
再回头来说针对新冠肺炎的试剂盒。因为救急如救火，为了应对紧急公共卫生事件，事急从权，简化一部分研发以及临床试验的流程是需要的，也是符合需求的。但是简化不等于不做。质量检和正式临床试验可以暂时不做，但是基本的研发流程，少量的预临床试验，以及标准化生产都是需要的。
简化的研发，比如我们至少要知道到底那种体液最灵敏，咽拭子，唾液，痰液，肺泡灌洗液？需要多少量？如何采集？这是都是需要制定最基本的标准的。否则数据之间无法比较，就更谈不上稳定性了。另外，现有试剂盒的能够检测的最低拷贝数是多少。在PCR检测上，它有个下限。如果拷贝数低于下限则会检测不出来或者数据不稳定。如果单纯知道序列去合成一个人工的序列，把它作为阳性，因为含量高，很容易检测得到。如果这个时候，我们就说试剂盒研发成功了，那是不对的。因为在病人体内，尤其是早期阶段或者经过一定的治疗以后，病毒的拷贝数可能会非常低，以人工合成的序列为参照并且没有优化过的试剂盒很有可能检测不到，就出现大量漏诊或者误以为阳转阴的情况。这也是为什么很多专家说，在CT影像发现了，但是核酸检测有滞后的一个最主要的原因。这也是为什么有些患者核酸检测阳转阴，但是突然恶化的原因。而理论上讲，如果是合格的试剂盒（选择正确的体液样品和优化的低度），核酸检测应该更灵敏才对。少量的预临床试验，疫情紧急，几百例的预临床试验不可能，但几十例还是得做的，以确保特异性和灵敏度，不然就会出现高假阳性和高假阴性的情况。试剂如此，疫苗和药物更是如此。尤其这几十例里面多数都应该是轻症患者的样品，并且包括一部分经过治疗但是尚未痊愈的患者的样品，以尽可能的去模拟临床场景。这样才能相对准确的知道开发的试剂盒对轻症患者的灵敏度。如果试剂盒在这个阶段达不到要求，则需要尽快的回到研发阶段，进行进一步的优化和调整。而达到要求的试剂盒，则可以考虑后续用到临床。高灵敏度和特异性的试剂盒对于减少漏诊误诊非常重要。漏诊的危害其实很大，被核酸诊断打上未感染标签的感染个人，往往放松警惕更容易感染他人。误诊则会导致非新型冠状肺炎的患者跟真正确诊的患者一起治疗造成感染，也可能导致错误的阳转阴的判断。但是做预临床试验，我们需要特别注意，新冠肺炎阳性样品是具有感染性的，应该在有病原生物尤其是病毒检测资质的实验室才能进行检测。而有这种资质的机构其实很少。而标准化生产，这个大多数做过核酸诊断试剂盒的公司都可以完成。这个并非是限速步骤。最大的问题并非产量，而是质量
因此，现在新冠肺炎试剂盒最大的问题可以说并非产量，而是质量。从一些报道来看，病人要经常要做上三四次核酸检测，甚至是四五次的实验，才知道是阳性还是阴性。而就算这样，可能还有好多人检测出来是阴性，但已经出现白肺了。或者有些人核酸检测阳转阴了，但其实是假阴性。这就说明，好些试剂盒在早期研发的时候，并未完成试剂的优化，质控，灵敏度特异性测试等等，所以导致灵敏度不够，检测的结果不稳定。
在现在的非常时刻，需群策群力，我觉得可以考虑统一调度，将上述三个环节拆分开，以提高试剂盒的研发效率。比如研发阶段可以鼓励多家机构或者公司来参与，很快做出多种试剂盒的方案，然后通过一个专家委员会评议来确定几种进行后续小规模的预临床试验。这个预临床试验为避免感染，可委托给几家有病原生物检测尤其是病毒检测资质的机构进行（主要是有P3实验室）。通过预临床试验选出灵敏度特异性最好且最稳定的一个或者几个试剂盒，然后再委托给有GMP资质和经验的厂家进行标准化的批量生产。这样一来，短期内还是有可能可以开发出应急的医用临床试剂盒。当然需要注意的是，就算这样开发出来的试剂盒因为流程过于简化（临床试验规模太小，试剂稳定性缺乏验证等），也是“不完善”产品，不能把不完善的产品当作完善产品使用、宣传和推广。更不能把不完善产品当作“金标准”来使用，一定需要结合临床的指针和经验，尤其肺部CT的证据。鉴于目前已经有了多个品牌的试剂盒在使用，也存在一定的假阴性问题，《知识分子》的编辑问有没有一些可操作性的建议。我想，或许可从这几方面考虑：1）如果有稍微做过些临床实验的试剂盒，以后尽量用这类试剂盒；2）复盘不同品牌试剂盒的实际临床效果，推进用效果好一些的试剂盒；3）对于阳转阴患者，尽可能用下肺段的肺泡灌洗液进行检测，以提高准确性；因为试剂盒已经用于临床了很难再调整，实际检测中只能增加样品中的含量的，那么越靠近实际病发部位的，病毒含量越高。4）鉴于大量试剂盒仅为初级产品，数据绝对不能用作金标准，务必结合临床判断。另外，1和2的建议看似可行，其实很难。医务人员已经很忙了，数据统计难度不小，如何做复盘，也是一个问题。如果因为对感染的担忧，做不了肺泡灌洗液，考虑4还是很有必要的，就是依赖临床判断。严格按照流程开发出来的符合质量标准且经过临床验证的核酸试剂盒确实可以作为金标准。但是新型冠状病毒的检测试剂盒是从无到有的原研开发，没有标准流程可以照搬，理论上是需要较长的开发时间，目前的试剂盒多数是仓促上线缺乏临床验证，质量不稳定还可能添乱。因此，做事情一定要从实际情况出发，不能违背规律。
作者简介
杨蓉西教授主要从事肿瘤分子流行病学的研究，着重于肿瘤早期诊断，复发监控、疗效评估和预后评估的分子标志物的开发，曾在德国主持过体外诊断试剂盒的研究、开发和临床转化。
