基因编辑秘籍：如何提高果蝇的抗毒能力？-资讯-知识分子

基因编辑秘籍：如何提高果蝇的抗毒能力？

2019/10/05

导读

回望所来径，仿佛若有光。

Sylvain CORDIER/GAMMA-RAPHO

撰文 | 杨小灵（普林斯顿生态演化系博士生）

责编 | 汤佩兰

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“美丽的东西总是有毒的”，这句话放在帝王蝶身上可不会错。帝王蝶原产于北美，黑橙相间，身形硕大；不仅如此，其还是世界上唯一能进行长距离迁徙的蝴蝶，由加拿大至墨西哥将近5000公里，成千上万只蝴蝶一同展翅飞旋，实在壮观。

话说 “适千里者，三月聚粮”，可谁知帝王蝶的幼虫竟然吃且仅吃一种叫作“乳草”（milkweed）的有毒植物。乳草分泌的毒素叫 “强心甾” （cardenolide），专门和动物体内的钠钾泵结合，量少时可治疗心功能不全，量大则致命，人类误食通常会非条件反射地呕吐出来。

钠钾泵，顾名思义，是维持细胞内外钠钾离子浓度稳定的重要转运酶，发现它的丹麦科学家斯科（Skou）还于1997年获得了诺贝尔化学奖。钠钾泵被强心甾 “结合”之后就不能正常工作了，进而渗透压失衡细胞破裂，后果有多严重可想而知。乳草就凭借着这一强大的 “化学武器” 驱散觊觎自己的昆虫们。

但帝王蝶的幼虫却视若无睹，照吃不误。这还不算，帝王蝶还能将乳草的毒素储存在自己的身体里。吃顿饭的工夫自己也有了 “化学武器” ，这一招可吓得捕食者们纷纷绕道而行，从此明艳美丽的帝王蝶招摇过市，再无畏惧。

这是如何做到的呢？原来帝王蝶的钠钾泵发生了突变，这样一来强心甾就不再能够紧密地结合了，自然也就不会妨碍钠钾离子的正常转运了。

日前，加州大学伯克利分校的诺亚·怀特曼（Noah Whiteman）实验室和哥伦比亚大学的彼得·安德伐特（Peter Andolfatto）实验室，分别独立发现了帝王蝶的这种抗毒性主要由三个氨基酸突变造成，并通过不同的基因编辑技术将这三个小突变转入果蝇，使原本不抗毒的果蝇对强心甾的抗性提高了最多1000倍，俨然成了 “帝王蝇”。二者的结果分别发表在最新一期《自然》（Nature）和八月底的eLife 上。

其实不仅帝王蝶，直翅目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、双翅目、鳞翅目都有个别昆虫演化出了食用有毒乳草的神奇能力。测序技术的发展使科学家们发现这些能够抵抗强心甾的昆虫的钠钾泵均有突变，且为多次独立演化。所有突变中，111，119，122 这三个位点上的突变频率最高，这引起了研究人员的格外注意。

怀特曼组通过 Crispr-Cas9 基因编辑技术，构建了含有这三个位点的突变的转基因果蝇。针对抗毒性的检测发现，当引入111突变时抗性略有增加，引入119突变基本不变，111+119 双突变比111单突变的抗性要强，122单突变使抗毒性大幅增强，但还是111+119+122全部三个突变同时存在抗毒能力最强，增加了几乎1000倍，和帝王蝶的抗毒水平持平。

同时怀特曼组也对转基因果蝇进行了 “癫痫-瘫痪” 测试。这个实验是将果蝇置于瓶内剧烈晃动，并记录其恢复站立所需时间，用以反映神经系统应对突发机械刺激的能力。正常野生型果蝇会在震动后立即重新站起，但具有突变的果蝇就没有那么健康了。比如只有122突变的果蝇平均花费90秒才能重新站立，111突变的果蝇花费约50秒，而119突变的果蝇和野生型并无二致。111+119双突变和111+119+122三突变的果蝇组内差异较大，但平均下来仍接近正常野生型果蝇。

这与此前发表的安德伐特组的研究结果一致。通过 attP 基因编辑技术，安德伐特组构建并检测了单个突变和组合突变的纯合果蝇与杂合果蝇——因为当突变最开始出现在二倍体中时一定是杂合状态的，所以对杂合体的评估更能准确地了解抗毒性出现的演化路径。基因表达检测显示，在杂合果蝇中，突变钠钾泵和正常钠钾泵在表达量上并无差异；突变钠钾泵的抗性显著增加，纯合的抗性高于杂合； “癫痫-瘫痪” 测试中纯合却比杂合需要更漫长的恢复时间。但无论在哪一种组合中，111+119或119+122的双突变果蝇均比单突变的抗毒能力更强、应对外界刺激的应对能力更优。安德伐特组还将搜索范围扩大到了所有食用乳草的昆虫，囊括了所有这三个位点上的常见突变，以上结果仍然成立。

总结一下，虽然122位点的突变抗毒能力强，但副作用也最强；119位点的突变虽不抗毒，但也没什么副作用；111位点的突变介于二者之间。于是推断，111和119上的突变共同演化，122上的突变于其后出现。这也正符合系统发生上我们所见到的规律：多数食用乳草的昆虫同时拥有111和119位点上的突变，而拥有122突变的生物，通常也都具有111和119上的突变。另外，单个突变刚出现时以杂合的形式存在来避免强烈的副作用；直到后续突变陆续出现将副作用减弱，纯合体才逐渐占据优势将突变固定下来。正是沿着这样的路径，本无法抵抗乳草毒液的果蝇，一步一步成为了钠钾泵功能无多损失，但却和帝王蝶抗毒能力不相上下的 “帝王蝇”。

这两项研究首次通过基因编辑在多细胞生物体内重现演化路径，并且证明了路径的选择是十分有限的。首先钠钾泵上与强心甾接触的位点数量有限，所以只有当随机突变出现在这些接触的位点上时才会引起抗毒性的改变。其次，绝大多数突变都是有害的，比如减弱钠钾泵自身的工作效率，引发神经与行为上的异常，这样的突变会被淘汰。最后，正如这两项研究表明的，突变的顺序也很重要。纵然111和122这两个位点上的突变能使昆虫获得强大的抗毒能力，但也影响了它们的神经系统，119位点上的突变则缓解了这种“副作用”，使得111和122上的突变 “暗度陈仓”，在漫长的历史与强大的选择压力下得以保存。总之以上种种因素限制了演化的速度，但也同时构成了趋同进化的遗传基础。

哈佛大学生物与进化生物学教授霍皮·胡克斯特拉（Hopi Hoekstra）称赞这两项研究是 “近期看到最欣赏的”、“完整漂亮的故事”。芝加哥大学生态与进化系副教授马库斯·克朗福斯（Marcus Kronforst）则称二者是 “令人钦佩的”、 “少有的通过在其它物种中重现某种形状来证明突变的作用的研究”。

在此之前，演化学家们通常将目光集中在现存的生物当中，但这两项研究使人们知道可以通过基因编辑对突变之间的相互作用进行研究，一步一步复原最有可能的演化轨迹。

回望所来径，仿佛若有光。

参考文献：

[1] Karageorgi, M., Groen S.C., Verster K.I., Aguilar J.M.,Sumbul F., Hastings A.P., Pelaez J.N., Bernstein S.L., Matsunaga T., Astourian M.,Guerra G., Rico F., Dobler S., Agrawal A.A. & Whiteman N.K. 2019. Genome editing retraces the evolution of toxin resistance in the monarch butterfly. Nature. 232.

[2] Taverner A., Yang L., Barile Z., Lin B., Peng J.,Pinharanda A., Rao A., Roland B., Talsma A., Wei D., Petschenka G., PalladinoM. and Andolfatto P. 2019. Adaptive substitutions underlying cardiac glycoside insensitivity in insects exhibit epistasis in vivo. eLife. 8.doi: 10.7554/eLife.4822

杨小灵

普林斯顿生态演化系博士在读

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